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                          博仕奥通讯第十期

                   

                 

                   

                   

                   
                     
                 
                脂肪酶活力测定法子的探讨

                尹翠金

                (88老虎机网址 510663

                脂肪酶是一种特殊的水解酶广泛地在于动物组织、植物种子和微生物体中,是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸,将天然油脂水解为脂肪酸及甘油,同时也能催化酯合成和酯交换的酶。在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来随着非水酶学和介面酶学的不断深入脂肪酶应用也不断地扩展被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面应用后景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+甘油二酸酯+游离脂肪酸甘油酸酯+游离脂肪酸甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系即在油-水介面上作用对水溶性底物无作用这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。

                1 滴定法(参照国家标准,适用于脂肪酶制剂)

                1.1 脂肪酶活力界说

                1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度的pH条件下,1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸,即为一个酶活力单位,以u/gu/mL)表示。

                1.2 测定原理

                脂肪酶在一定条件下,能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油,所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定,用pH计或酚酞指示反应终点,根据消耗的减量,计算其酶活力。反应式为:RCOOH+NaOHRCOONa+H2O

                1.3 仪器设备

                    恒温水浴箱,移液枪,高速匀浆机,pH计,电磁搅拌器

                1.4 试剂溶液

                95%酒精

                4%聚乙烯醇(PVA,聚合度1750±50):称取4g PVA,加蒸馏水80mL,沸水中加热,并不断搅拌,使其完全溶解,慢速搅拌,免于产生过多气泡,冷却后定容至100mL,用双层纱布过滤后备用。

                橄榄油(辨析纯)

                底物溶液:按4%聚乙烯醇:橄榄油=3:1比例混合,用高速匀浆机处理6min(分两次处理,间隔5min,每次处理3min)。

                pH7.5盐酸缓冲液:称取十二水盐酸氢二钠39.62g,盐酸二氢钾1.96g,用水溶解并定容至500mL,调节溶液的pH7.5±0.05

                0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。应用时稀释10倍。

                10g/L酚酞指示液:GB/T603配制。

                1.5 待测酶液的制备

                称取酶样品1g~2g,精确至0.0002g,用盐酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末,可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时控制酶液浓度,样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。

                1.6 测定

                1.6.1 电位滴定法

                ①按pH计应用附识书进行仪器校正;

                ②取两个100mL高脚杯,分别作为空白A和样品B,分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL,再于A中加入95%酒精15.00mL,于40±0.2℃水浴中预热5min,然后各加1mL酶液,立即混匀计时,准确反应15min后,于B中立即补加15.00mL 95%酒精终止反应,取出。

                ③在高脚杯中加入一转子,置于电磁搅拌器上,边搅拌,边用氢氧化钠标准溶液滴定,至pH10.3,为滴定终点,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

                1.6.2 指示剂滴定法

                ①取两个100mL三角瓶,分别作为空白A和样品B,分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL,再于A中加入95%酒精15.00mL,于40±0.2℃水浴中预热5min,然后各加1mL酶液,立即混匀计时,准确反应15min后,于B中立即补加15.00mL 95%酒精终止反应,取出。

                ②于AB瓶中各酚酞两滴,用氢氧化钠标准溶液滴定,直至微红色并保持30s不退色为滴定终点,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

                1.6.3 计算

                    脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算:

                式中:

                X1——样品的酶活力,u/g

                V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(mL);

                V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(mL);

                c——氢氧化钠标准溶液,单位为摩尔每升(mol/L

                50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol

                n1——样品的稀释倍数;

                0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;

                15——反应时刻15min,以1min计算。

                2 铜皂法(非国家标准,仅供参考)

                2.1 药物、试剂及仪器

                0.0667 mol·L-1KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为6.476.987.388.048.67),脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液,用吡啶调节pH=6.1),苯,甲苯,油酸,橄榄油,盐酸。

                分光光度计,pH计,水浴恒温磁力搅拌器,离血汗,辨析天平。

                2.2 法子

                2.2.1 脂肪酸吸光度工作曲线的绘制

                配制一系列不同浓度的油酸溶液,分别取4 mL于锥形瓶中,加入1 mL显色剂,磁力搅拌3 min,油酸分子与Cu2+生成绿色的络合物,离心后取上层有机相在710 nm处测定吸光度。用未加油酸的空白溶液作参比,以吸光度对油酸浓度作图,得一直线,即为脂肪酸吸光度工作曲线。

                2.2.2 酶活测定法子

                3mL 0.0667 mol·L-1盐酸盐缓冲溶液和1mL橄榄油,放入水浴恒温磁力搅拌器37℃中预热5min,加入0.1mL酶溶液,磁力搅拌10min,立即加入8mL苯,继续搅拌2min,终止反应,同时萃取生成的脂肪酸。将溶液转移至离心试管中,在4000 r·min-1下离心10min,有机相和水相分层弄清。取上层有机相4mL于小锥形瓶中,加入1mL显色剂,在磁力搅拌器上搅拌3min,产生的脂肪酸与Cu2+生成绿色络合物。4000 r·min-1下离心10min,取上层含有脂肪酸铜的苯溶液,用分光光度计在710nm波长处测其吸光度。以相同法子制备不含脂肪酶的空白溶液为参比,对照脂肪酸吸光度工作曲线,即可求得脂肪酸的浓度。

                2.2.3 改进后的脂肪酶活力测定法子

                用甲苯代替苯作有机溶剂萃取剂,其它步调不变。

                2.2.4 酶活界说及计算公式

                脂肪酶酶活力单位界说为:

                在一定条件下,每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量界说为1个脂肪酶活力单位(U)

                计算公式:

                X=cV/tV′)

                式中:

                X为脂肪酶活力,U·mL-1c为脂肪酸浓度μmol·mL-1V为脂肪酸溶液的体积,mLV′为酶液的用量,mLt为作用时刻,min

                3 对硝基苯酚法(非国家标准,仅供参考)

                3.1 药物、试剂及仪器

                对硝基苯酚(p-NP),对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH8.0),异丙醇,阿拉伯胶,Triton X-100

                辨析天平,恒温槽,pH计,分光光度计,酶标仪。

                3.2 法子

                3.2.1 配制p-NPP底物溶液(0.09 mg·mL-1)和p-NP标准溶液(0.03 mg·mL-1);将p-NP标准溶液稀释成适当的梯度,分别测定吸光度,绘制吸光度-浓度瓜葛曲线。取4mL p-NPP底物溶液,预热5 min后加入1mL酶液,反应10 min后立即加入一定体积乙醇或丙酮均匀混合终止反应(将1mL去离子水替换1mL酶液,其它条件不变,即得空白),于405 nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度,进而计算出酶活力。

                3.2.2 改进后的脂肪酶活力测定法子

                取一系列p-NP标准溶液稀释到5mL,呈适当的浓度梯度,加入5mL 0.5 mol·L-1的三氯乙酸混合,再加入5.15mL 0.5mol·L-1NaOHpH值,直至pH值与加酸前一致,分别测定吸光度,绘制吸光度-浓度瓜葛曲线。终止反应过程中,反应10 min后立即加入5mL 0.5 mol·L-1的三氯乙酸混合均匀,放置5min终止反应,再加入5.15mL 0.5 mol·L-1NaOHpH值,直至pH值与反应前一致,其它条件不变。

                3.2.3 酶活界说及计算公式

                脂肪酶酶活力单位界说为:

                在一定条件下,每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量界说为1个脂肪酶活力单位(U)

                按下式计算酶活:

                X=cV/tV′)

                式中:

                X为脂肪酶活力,U·mL-1c为对硝基苯酚浓度,μmol·mL-1V为酸碱调节后的反应液终体积,mLV′为酶液的用量,mLt为作用时刻,min

                4 讨论

                影响脂肪酶测定结果有很多要素,其中底物、反应温度和pH要素影响最大。

                在滴定法中,以前国外有报导测定脂肪酶酶活时,不将底物制成乳化液,直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应,然后用碱滴定生成的脂肪酸。不乳化测得的结果平行性较差,这可能是反应过程中的随机误差引起的。因为不乳化时,反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中,水与油是互不相溶的,必然造成体系的不均匀,酶不能与底物充分接触,反应不完全,因此测定的平行性较差,可比性也差。

                虽然PVA对该酶解反应有抑制作用,PVA增加了体系的粘度,使反应体系的流动性变差,对酸碱滴定也会产生一定影响,但综合考虑,它能形成较均匀的乳化体系,使酶能与底物充分接触、反应,随机误差大大减小。平行测定中,PVA的影响作为系误差可主从抵消,具有可比性,故宜采用加PVA制成乳化液这样的反应体系。

                酶都有其最适的反应温度,在不同温度下酶所表现的活性也不同,温度的升高可以加快反应速度,但会引起酶蛋白变性失活。

                同一浓度的碱性脂肪酶在相同的温度下,对同样的底物作用,在不同的pH环境中,所测得的酶活也不同。

                三种测定法子的测定结果在数值上有一定异样,不能相互替代。滴定法测定速度较快,可以用于粗略的测定,但准确性不高;改进的铜皂法用甲苯代替苯,减小了毒性,结果稳定、重复性好;对硝基苯酚法比其它两种法子在数值上小得多,因此,在对脂肪酶酶活性进行表述或提出具体限量要求时,应明确测定法子。

                (参考文献略,需者可函索)

                 

                 

                 

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