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                          博仕奥通讯第十期

                   

                 

                   

                   

                   
                     
                 
                芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质

                黄鹭强,谢必峰,黄建忠,吴松刚

                (福建师范大学生命科学院,福建福州 350108

                摘 要:芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、Sephaeryl S200柱层析、CM Sephrose FF

                柱层析,得到纯化的脂肪酶,纯化倍数为9.45倍,活性回收率为4.27%。对该酶性质研究表明:该酶水解橄榄油的最适温度为50 ,最适pH8.0,在60℃以下和pH 410之间有很好的家弦户诵。K+Mg2+对该脂肪酶的水解活性有促进作用,而Na+Mn2+Ca2+对脂肪酶则没有显著的促进作用。Fe2+对酶活的抑制作用不明显。浓度为0.1%时,Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用;Brij 35Tween-80对酶活力的影响不明显;离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用。

                关键词:芽孢杆菌  脂肪酶  分离纯化  性质

                脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)是一类水解酶,可催化油脂水解,产生甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油,脂肪酶已广泛应用于食品加工、洗涤剂、造纸、皮革加工等行业,还具有化学选择性和高度的立体异构专一性,近年来在手性药物生产、生物柴油制造等领域的报道较多。微生物脂肪酶资源丰富,具有在有机溶剂中家弦户诵好、广泛的底物特异性、高度的选择性等特点。目前,生产商应用的脂肪酶大多数来源于微生物,属常温酶,高温下反应受限制。

                芽孢杆菌产生的脂肪酶具有耐热、抗碱等特点,可在有机相中催化各种反应,应用潜力大。本课题组从土壤中分离并筛选到1株细菌,经研究鉴定为芽孢杆菌,编号WF63。海内对芽孢杆菌产生的脂肪酶报道较少。本文对芽孢杆菌WF产生的脂肪酶的分离纯化法子进行研究,并探讨其酶学性质,为其进一步应用奠定基础。

                1 材料与法子

                1.1 材料

                1.1.1 菌株

                芽孢杆菌(Bacillus sp.)WF63:由本实验室分离、筛选并封存。

                1.1.2 试剂

                橄榄油、PVA 124、硫酸铵、Tween-80等试剂购自中国医药(集团)上海化学试剂公司;Triton X-100Brij 35购自AMRESCOSephacryl S-200凝胶、CM Sepharose FF凝胶购自Pharmacia;其他普通试剂均为国产辨析纯试剂。

                1.1.3 仪器

                Pharmacia低压液相层析系;Beckman冷冻离血汗;Uhrospec 2000可见-紫外分光光度计等。

                1.1.4 培植基

                种子培植基(g/l):葡萄糖10,牛肉浸膏2,蛋白质5,酵母浸膏1pH 7.2

                发酵培植基(g/l):麦芽糖12,牛肉浸膏3,蛋白质5K2HPO4 0.5,橄榄油乳化液1%(V/V),pH7.5

                1.2 法子

                1.2.1 WF63脂肪酶的发酵

                挑取斜面活化菌种接入装有20mL种子培植液的250mL三角瓶中,30220 r/min培植24 h,种子培植液按5%接种量接种于装有25mL发酵培植基的250mL三角瓶中,30200r/min培植50 h达到产酶高峰。

                1.2.2 WF63脂肪酶的硫铵沉淀

                收集发酵液,410000r/min离心10min,获得上清液。按10~70%的饱和度在上清液中不断搅拌添加硫酸铵,置于低温(4℃)盐析过夜,冷冻离心后取沉淀,即得粗酶。

                1.2.3 Sephacryl S200柱层析

                将硫酸铵沉淀获得的粗酶,用pH9.00.05mol/L Gly-NaOH缓冲液重新溶解,8000r/min4℃离心10min,取上清液,以pH 9.0 Gly-NaOH缓冲液,流速为1.2 mL/min上柱,收集具脂肪酶活性的区段。

                1.2.4 CM Sepharose FF柱层析

                将上一步纯化得到酶液,在pH7.00.02 mol/L盐酸缓冲液充分平衡的CM Sepharose FF层析柱上,再分别用pH7.0 0.4 mol/L NaCl1 mol/L NaCl的盐酸缓冲液进行阶段洗脱,流速为0.8mL/min,收集有脂肪酶活性的区段。

                1.2.5 酶活测定法子

                滴定法参照文献的法子。酶活界说:在37℃,pH9.0的条件下,每分钟水解脂肪分解产生1 mol的游离脂肪酸所需的酶量界说为1个脂肪酶活力单位。

                1.2.6 可溶性蛋白测定

                以牛血清白蛋白为标准蛋白,采用文献法子进行测定。

                1.2.7 脂肪酶分子量

                脂肪酶分子量测定采用文献法子。浓缩胶浓度为3%,分离胶浓度为15%。

                2 结果与辨析

                2.1 酶的纯化

                分别测定芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液、硫铵沉淀液、分子筛层析液和离子交换层析液的总蛋白和酶活力,计算该脂肪酶每步实验的总酶活、比酶活、纯化倍数和回收率,比较每步纯化的效果,结果见表1

                由表1可看出芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液经过离心去菌体,上清液60%硫酸铵沉淀、Sephaeryl S200柱层析、CM Sephrose FF柱层析,被纯化了9.45倍,活性回收率为4.27%。硫酸铵沉淀总酶活力损失较小,而蛋白质总量变较大,可见杂蛋白的去处效果较好。对纯化后的脂肪酶进行SDS-PAGE凝胶电泳。图1中的1由上至下分别为6种标准蛋白:兔盐酸化酶B97400);牛血清白蛋白(66200);兔肌动蛋白(43000);牛碳酸酐酶(31000);胰蛋白抑制剂(20100);鸡蛋清溶菌酶(14400),2为对照标准蛋白,计算对立分子量。由图1可知,SDS-PAGE凝胶电泳纯化后的脂肪酶为单一条带,其对立泳动率与分子量对数呈现很好的线性瓜葛,估计该酶的分子量约为32 ku左右。

                2.2 酶学特性研究

                2.2.1 芽孢杆菌WF63脂肪酶的最适温度和温度家弦户诵

                25~65℃下分别测定脂肪酶活力,取等量的脂肪酶分别置于30~60℃下保温,30min后测定残余酶活,结果见图2

                由图2可知,该脂肪酶在2565℃都保持一定的活力,最适温度为55℃。附识该酶的最适温度在中喂の穸围;该酶在30~60℃保持较高的活性(残余对立酶活在75%以上),附识该酶可在较宽的温度范围内作用。

                2.2.2 芽孢杆菌WF63脂肪酶的最适pHpH家弦户诵

                在测定酶活的反应体系中加入不同的缓冲液,测定脂肪酶的酶活。酶液分别与一定量的缓冲液(pH 411范围)混合,放置在室温(25℃)下6 h,取出后在40℃测定残余酶活,结果见图3

                由图3可知,在pH48的范围内,该脂肪酶的对立酶活随着pH增加而增加,在pH8.0最高,而后随着pH增加而下降,最适pH8.0;在pH4l0的范围内,该酶残余对立酶活在60 以上,附识该酶pH家弦户诵较好。

                2.2.3 不同金属离子对芽孢杆菌WF63脂肪酶活力的影响

                将含有不同金属离子的盐溶液与一定酶液混合,终浓度为5 mmolL,同时以不加金属离子的酶液作为对照,测定不同离子对脂肪酶活力的影响,结果见图4

                由图4可知,K Mg 对该脂肪酶活力有一定的促进作用;Na+Mn2+Ca2+对该脂肪酶活力影响不大;Fe2+对酶活的抑制作用不明显;Ag+cu2+等属于重金属离子,抑制作用明显。

                2.2.4 不同表面活性剂对芽孢杆菌WF63脂肪酶活力的影响

                将不同浓度(0.1%0.5%)的非离子型表面活性剂溶液与一定酶液混合20min,同时以不加表面活性剂的酶液作为对照,测定不同表面活性剂对脂肪酶活力的影响,结果见图5

                由图5可知,当浓度为0.1%时,非离子型表面活性剂对脂肪酶有活化作用,尤其是Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用;Brij35Tween-80对酶活力的影响不明显;离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用。当表面活性剂的浓度达到0.5%时,非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂对脂肪酶活力都表现出不同档次的抑制作用。

                3 结论

                3.1 芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液经过离心去菌体,上清液60%硫酸铵沉淀、Sephaeryl S200 柱层析、CM Sephrose FF 柱层析,被纯化了9.45倍,活性回收率为4.27%。硫铵沉淀纯化后总酶活力损失较小,Sephaeryl S200 柱层析酶活损失较大。脂肪酶在SDS-PAGE凝胶电泳图上为单一条带,该酶的分子量约为32ku左右。

                3.2 水解橄榄油实验,附识该脂肪酶酶的最适温度为50,最适pH8.0,在60℃以下和pH4~10之间有良好的家弦户诵,附识该酶为中温脂肪酶。

                3.3 离子对该脂肪酶的家弦户诵实验表明:Ca2+对该脂肪酶活力影响不大,这与有关Ca2+对脂肪酶有激活作用的报道不同。非离子型表面活性剂Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用,而Tween-80对酶活没有明显的促进作用与报道不同。

                3.4 该酶表现的特性和传统的微生物脂肪酶有明显的不同,在研究和应用上潜在应用价,今后可进一步深入探讨。

                (参考文献略,需者可函索)

                 

                 

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