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                饲料中β-甘露聚糖酶的检测法子和博特美耐高温试验

                撮要:本文附识了一种饲料中β-甘露聚糖酶活力测定的法子,先用透析袋将饲料中的酶液浓缩,再经透析定容,然后用DNS法测出酶活力。北京博仕奥生物技能有限公司生产的博特美TM β-甘露聚糖酶经高温制粒后,用上述检测法子,测定其制粒后的酶活力存活率为89.77%

                关键词β-甘露聚糖酶;酶活力;耐高温

                酶是活细胞产生的具有生物催化活性的蛋白质,酶的家弦户诵即酶蛋白分子构象的家弦户诵一直是饲料行业关注的一个话题。以往的一些有关酶制剂耐高温试验主要是在实验室的烘箱中进行,虽然有一定参考意义,但是不能很好地反映饲料生产中的真实生产过程及饲料成分的繁杂性对酶的影响。本文提供了一种在传统DNS法的基础上加以改进的可以测定饲料中β-甘露聚糖酶的法子,并运用此法测定饲料实际生产过程中制粒前后酶活的变,研究博特美TMβ-甘露聚糖酶的耐温性问题。

                1  原理

                β-甘露聚糖酶能从底物LBGGumLocus Bean 刺槐豆粉)中水解产生还原糖,还原糖的产生量与酶活性成正比,用DNS显色法测定还原糖的含量,从而计算出酶活力。

                酶活力单位(U)的界说:在40.pH6.0的酶活力测定条件下,1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量界说为一个酶活力单位(U),其中样品的酶活力以U/g(固体酶)或U/ml(液体酶)表示。

                2  材料与法子

                2.1  材料

                博特美TMβ-甘露聚糖酶(微丸)由北京博士奥生物技能有限公司提供,外观为红色球状,含量为≥18U/g

                2.2  制粒情况及取样

                为保证测定的可靠性,博特美TMβ-甘露聚糖酶的添加水平比实际生产添加量扩大5倍,即每吨全价肉鸡料添加1.5公斤博特美TMβ-甘露聚糖酶。在广州某饲料厂肉鸡料生产线上进行制粒试验,制粒温度为91在混合机进行原材料混合后随机抽取3个样,各约1公斤;经制粒后在成品出口处随机抽取3个样,各约1公斤

                2.3  酶活性的测定法子

                2.3.1 标准曲线的制作

                分别吸取10mg/ml甘露糖标准液01.02.03.04.05.06.0100ml容量瓶中,用0.1MpH6.0乙酸-乙酸钠稀释至刻度,得到0100200300400500600ug/ml的标准稀释液。取不同浓度稀释液各1ml于刻度试管中,加1ml 0.1MpH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液,DNS试剂3ml,于沸水浴沸腾5min(样品放入重新沸腾开始计时),取出后立即用自来水冷却至室温,并加入蒸馏水定容至15ml,混匀,以不含甘露糖的为空白,在540nm分别测定其吸光度OD值,记录OD值。

                以吸光度OD值为横坐标,以相应甘露糖浓度为纵坐标,绘制出标准曲或作回归方程(R20.999曲线才能应用,否则应重做)。每次新配制DNS试剂均需重新绘制标准曲线。

                2.3.2  饲料中β-甘露聚糖酶的测定

                2.3.2.1 待测酶液的制备

                准确称取5g样品精确至0.0001g,置于50ml容量瓶中,加入约30ml 0.1M pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶液,在磁力搅拌器上高速搅拌30min(这很重要,抽提时刻不足对酶影响很大),用0.1M pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至刻度(减去磁力搅拌棒的体积)摇匀,过滤。

                将滤液转入透析袋中,外加聚乙二醇,放于4℃冰箱浓缩到一定体积。洗净透析袋外面的聚乙二醇,放入0.1mol/LpH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液中透析,4℃冰箱过夜。取出定容,等待反应。

                2.3.2.2  酶活力的测定

                吸取10.0ml 10mg/mlLBG底物溶液(2.2.4),40℃平衡10min

                酶空白样的制备

                吸取1.0ml经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡),加入到刻度试管中,再加入3.0mlDNS试剂,振荡3s,然后加入1.0mlLBG底物溶液,40℃保温20min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至15ml,振荡3s。以此作为下步反应空白调零样。

                酶反应样

                吸取1.0ml经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡)加入到刻度试管中,再加入1.0mlLBG底物溶液(已经过40℃平衡),振荡3s40℃精确保温20min.加入3.0mlDNS试剂,振荡3s,以终止酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至定温,加水定容至15ml,混匀。以酶空白样(为空白调零,在540nm测定吸光度OD值。需做2个平行)。

                查标准曲线或回归方程式,求出样品中还原糖量。OD值以0.15-0.45范围为宜,若不在此范围需改变稀释倍数后再做。

                2.4  计算公式

                2.4.1 酶活性计算公式

                式中:X——试样甘露聚糖酶的活力,U/gU/ml

                A——从标准曲线中查得的还原糖量,ug

                N——释倍数(从固体或液体样品到最终液的部稀释倍数);

                20——为反应时刻,min

                2.4.2酶活封存率计算公式

                3  结果

                从表1可以看出,91制粒温度条件下,博特美TMβ-甘露聚糖酶的酶活有一定档次的损失,但平均酶活封存率还是比较高,为89.77%

                4  讨论

                4.1  饲料生产中调质温度往往达到80-90,酶作为一种具有一定结构的活性蛋白质,假如不作处理,其活性主导易受到温度影响而失活变性。酶制剂耐高温稳定化处理的法子主要有:一是通过诱变或基因重组技能筛选耐高温菌株。二是添加稳定剂和载体吸附。三是采用包被技能处理。

                有关饲料制粒后酶活变的资料不多,其中主要原因是不容易找到一种有效检测全价饲料中酶活的法子,一方面是因为全价饲料中酶含量低,另一方面是由于受到多种底物的干扰。本试验采用了加大酶制剂添加量的法子,提高了全价料中酶的含量。另一方面通过测定制粒前后酶活封存率,排除了底物的干扰要素。

                博特美TMβ-甘露聚糖酶是采用基因工程菌深层液体发酵而成,88老虎机手机版式经过微丸和包被处理,试验表明,能耐受饲料生产中高达90制粒高温。

                4.2  从上表1#2#的数据来看,1#的酶活力存活率为89.92%2#的酶活力存活率为89.68%,两组数据相差很小,证明了饲料中甘露聚糖酶酶活的测定法子准确。饲料中酶活的测定法子可以测定出饲料中真实的酶活力,从而对饲料的品质进行督察。

                饲料中甘露聚糖酶酶活力的测定法子非但可以用在测定饲料中甘露聚糖酶的酶活测定,还可用于测定其它酶活较低用普通DNS法不能测出酶活的样品。

                附录

                酶活性测定试验所需试剂与溶液配制

                ① 0.1mol/LpH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液

                称取三水乙酸钠13.06g,加入冰乙酸0.2ml。再加蒸馏水溶解,定容至1000ml,混匀。测定溶液的pH值。如果pH值相差6.0,用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至6.0,用精密PH试纸(或pH检测仪)检定。

                氢氧化钠溶液(200g/L

                称取氢氧化钠20.0g,加水溶解,定容至100ml

                ③ DNS试剂

                称取36-二硝基琥珀酸3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(2.2.2)同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热。同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热。冷却至室温后,用水定容至1000ml。用烧结玻过滤器过滤,将滤液储在棕色瓶中,避光封存。室温下存放7天后可以应用,有效期为6个月。

                ④ LBG(刺槐豆粉)底物溶液,浓度10mg/ml

                准确称取1.000g LBG(刺槐豆粉),加入90ml  0.1MpH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液中,磁力搅拌缓慢加热,直至LBG完全溶解,然后停止加热,继续搅拌30min。冷却后,用0.1MpH6.0乙酸-乙酸钠定容至100mlLBG底物溶液能立即应用,应用前适当摇匀。此溶液标记为10mg/ml LBG底物溶液PH6.04避光封存,有效期为3天。

                聚乙二醇6000

                ⑥ 10mg/ml甘露糖标准液

                称取无水甘露糖1.000g(应在105烘干至恒重),用0.1MpH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解,定容于100ml

                 

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